近日，我校生命科學學院胡宇飛課題組在Plant Journal上發(fā)表題為Efficient targeted T-DNA integration for gene activation and male germline-specific gene tagging in Arabidopsis的研究論文，該研究在擬南芥中實現(xiàn)高效T-DNA的定點插入，并開發(fā)了相關應用。
位點特異性DNA插入（site-specific DNA insertion）是作物育種和基因功能分析的重要工具，可以將功能性元件插入特定基因組位點，并可以避免插入基因在染色體不同位置所帶來的表達差異。在過去幾十年里，許多努力未能實現(xiàn)令人滿意的效率。傳統(tǒng)的位點特異性DNA插入方法基于同源重組修復（homology-directed repair，HDR）機制，然而，植物細胞中HDR的低活性使得需要多個世代，篩選大量后代，因而低效。與HDR介導的插入低效相比，農桿菌介導的T-DNA整合效率高，是植物遺傳工程的主要手段。然而，T-DNA整合依賴非同源末端連接（non-homology end joining, NHEJ）途徑，在植物基因組中的插入位點具有隨機性。
該研究開發(fā)了一種CRISPR/Cas9介導的擬南芥靶向T-DNA插入的方法，該方法比HDR介導的方法更快速、高效，并以此開發(fā)了基因激活和雄性生殖細胞特異性基因標記兩種應用。基因激活通過在T-DNA的LB端設置CaMV35S啟動子，定點插入激活特定的下游基因。利用該技術實現(xiàn)了FT和MYB26的激活，顯著增加了轉錄表達，分別導致早花和花藥內壁次生壁增厚模式的改變。雄性生殖細胞特異性基因標記的T-DNA中包含兩個報告基因，即NeoR和MGH3::mCherry，有助于創(chuàng)建定點插入突變體，簡化突變等位基因的遺傳分析，并可對受精過程的生殖細胞進行活體追蹤。該研究成功地將該系統(tǒng)應用于靶向精細胞特異表達，參與精卵識別的基因GEX2。
圖1. CRISPR/Cas9介導的T-DNA定點插入
生命科學學院碩士研究生許鵬和分析測試中心黃吉雷高級實驗師為共同第一作者，許鵬完成T-DNA定點插入主要實驗，黃吉雷完成電鏡細胞形態(tài)學觀察和體外受精實驗。生命科學學院胡宇飛副教授為通訊作者。莊楚雄教授對論文有貢獻。本文得到了國家自然科學重點基金，廣東省自然科學基金等項目的支持。
相關論文鏈接：http://dx.doi.org/10.1111/tpj.70104
生命科學學院 胡宇飛
