茶枝柑（Citrus reticulata cv. Chachiensis）是歷經(jīng)700多年馴化栽培的柑橘變種，其果皮制干即為中藥“廣陳皮”，含有多種生物活性成分。多甲氧基黃酮是廣陳皮中關鍵的藥用成分，但目前對其生物合成的遺傳基礎及調(diào)控機制知之甚少。
近日，華南農(nóng)業(yè)大學藥用植物研究中心聯(lián)合華大生命科學研究院、中國藥科大學、南京中醫(yī)藥大學，通過多組學技術破譯了茶枝柑基因組的遺傳圖譜，揭示了多甲氧黃酮合成的潛在通路以及基因調(diào)控網(wǎng)絡。該研究首次報道了一種新的甲氧基轉(zhuǎn)移酶基因CcOMT1，該基因被證實能夠直接合成氧化程度最高、生物活性顯著的3,5,6,7,8,3',4'-七甲氧基黃酮（HPMF）, 該化合物具有抗腫瘤起始的作用和抗神經(jīng)炎癥活性。這項研究從基因挖掘-代謝物合成-轉(zhuǎn)錄調(diào)控三個層次詳細闡述了廣陳皮活性成分多甲氧基黃酮的合成調(diào)控機制，為“廣陳皮”獨特的藥用成分形成及價值提供了科學支撐，該成果近日在國際學術期刊《自然通訊》(IF 16.6)上發(fā)表。
1.構(gòu)建染色體級別高質(zhì)量基因組圖譜，為茶枝柑遺傳育種和性狀改良提供數(shù)據(jù)支撐
研究人員通過短讀長測序數(shù)據(jù)與長讀長測序數(shù)據(jù)相結(jié)合的策略，以及Hi-C 輔助組裝技術，成功構(gòu)建了茶枝柑染色體級別的高質(zhì)量基因組，基因組大小為314.96Mb。茶枝柑基因組共含有蛋白質(zhì)編碼基因29,722 個，基因組進化分析表明，相比于莽山野橘，茶枝柑與克萊門氏柑橘的親緣關系更相近。茶枝柑果皮中含有種類豐富的多甲氧基黃酮，那么基因組中是否存在種類繁多的甲氧基轉(zhuǎn)移酶基因呢？ 研究人員通過同源序列比對以及從頭搜索的方式從茶枝柑基因中鑒定出了47個高可信度，且與多甲氧基黃酮合成直接相關的甲氧基轉(zhuǎn)移酶基因，包括39 個咖啡酸O-甲基轉(zhuǎn)移酶（COMT）基因和8 個咖啡酰輔酶A O-甲基轉(zhuǎn)移酶（CCoAOMT） 基因，主要分布在3號染色體和9號染色體上。
茶枝柑基因組圖譜
2.茶枝柑不同發(fā)育階段多甲氧基黃酮合成和積累的變化規(guī)律
每年的9月~12月是茶枝柑果皮采收的季節(jié)，不同時間段采收的果皮制作出來的陳皮也有不同的功效。研究人員通過對道地產(chǎn)區(qū)新會茶枝柑不同發(fā)育時期的花、葉以及果實等組織進行轉(zhuǎn)錄組測序研究，發(fā)現(xiàn)多甲氧基黃酮合成的關鍵酶 --甲氧基轉(zhuǎn)移酶在不同發(fā)育階段、不同組織中的表達模式存在差異。通過代謝組檢測，研究人員在茶枝柑的不同組織中共發(fā)現(xiàn)29種多甲氧基黃酮化合物，并且不同發(fā)育階段多甲氧基黃酮的相對含量存在差異，但是大多數(shù)化合物相對含量在花后200天（9月）的果皮中達到最高，研究結(jié)果支持該時間段是生產(chǎn)上茶枝柑果實采摘的適宜期。
3.首次發(fā)現(xiàn)一種新的甲氧基轉(zhuǎn)移酶基因CcOMT1，可合成具有抗腫瘤活性的化合物
3,5,6,7,8,3’,4’-七甲氧基黃酮（HPMF）具有抗腫瘤起始的作用，可能成為治療癌癥的潛在候選藥物，但其生物合成的途徑未知。從代謝組數(shù)據(jù)中，研究人員發(fā)現(xiàn)柚皮黃素（3-羥基-5,6,7,8,3',4'-六甲氧基黃酮）的相對含量與HPMF的相對含量顯著相關，并且從化合物結(jié)構(gòu)上推斷，柚皮黃素的3-羥基經(jīng)過甲基化后可以生成HPMF。基于上述推斷，研究人員進行相關酶的篩選與鑒定，成功表征出甲基轉(zhuǎn)移酶CcOMT1的活性，實驗證實該酶確實能夠催化柚皮黃素合成HPMF。同時，體內(nèi)瞬時過表達和基因沉默實驗均證明CcOMT1能夠顯著改變茶枝柑果皮中的HPMF含量。因此，CcOMT1被認為是茶枝柑中HPMF合成的候選酶，這也是首次報道的可直接合成HPMF的甲氧基轉(zhuǎn)移酶。
4.環(huán)境脅迫造就特殊的茶枝柑類黃酮基因表達調(diào)控網(wǎng)絡，進而形成特殊的黃酮組分
通過關聯(lián)分析研究人員還發(fā)現(xiàn)了以轉(zhuǎn)錄因子AP2/ERF、bZIP、WRKY等為核心的多甲氧基黃酮合成基因調(diào)控網(wǎng)絡。AP2/ERF-ERF這些轉(zhuǎn)錄因子，能夠響應干旱、鹽害等非生物脅迫，而這些環(huán)境壓力與茶枝柑的自然生長條件高度吻合。新會地區(qū)，作為茶枝柑的道地產(chǎn)區(qū)，其獨特的地理位置——西江支流、潭江以及銀洲湖出海口的交匯處，為茶枝柑的生長提供了特有的鹽脅迫環(huán)境。這種環(huán)境條件對茶枝柑的生長發(fā)育和次生代謝產(chǎn)物的合成具有重要影響。研究進一步發(fā)現(xiàn)，與廣東惠州、臺山和廣西玉林等非道地產(chǎn)區(qū)相比，新會地區(qū)的茶枝柑中，轉(zhuǎn)錄因子AP2/ERF-ERF、HB-HD-ZIP和LIM的表達量顯著更高。這種表達模式的差異，促進了多甲氧基黃酮合成相關基因的活性，從而增強了新會茶枝柑果實中多甲氧基黃酮的生物合成，為新會陳皮的高品質(zhì)形成提供了分子層面的解釋。
本研究是該課題組繼2023年3月在國際期刊Microbiome(IF 15.5)上發(fā)表“微生物和土壤養(yǎng)分影響茶枝柑活性成分單萜積累”的文章后，在茶枝柑活性成分多甲氧基黃酮合成調(diào)控機制及道地性評價領域取得的又一重要成果。
深圳華大生命科學研究院碩士生溫嘉雯、王亞玉副研究員、中國藥科大學陸續(xù)副教授、華南農(nóng)業(yè)大學博士生潘慧敏為該論文共同第一作者，深圳華大生命科學研究院劉歡研究員、南京中醫(yī)藥大學劉鄂湖教授、華南農(nóng)業(yè)大學吳鴻教授為論文共同通訊作者。
該工作得到了廣東省重點領域研發(fā)計劃(2020B020221001)、“十四五”廣東省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新十大主攻方向“揭榜掛帥”項目(2022SDZG07)、嶺南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學與技術廣東省實驗室科研項目等項目(NZ2021024)的資助。
文章鏈接：https://www.nature.com/articles/s41467-024-48235-y
